Koje se to ćelijske kulture koriste u proizvodnji vakcina? Već smo na Vakcine.ba pisali o ćelijskim/staničnim kulturama koje se koriste u proizvodnji pojedinih vakcina, konkretno atenuiranih, onih koje sadtže žive, ali oslavljene viruse. Taj tekst možete pročitati ovdje i odnosi se na debunk jednog mita o štetnosti tih kultura – ponavljamo – niti jedna od tih ćelija se ne nalati u vakcinama, a neophodne su da bi se vakcine proizvele.

Ovo je sad proširenje tog teksta, za one koji žele znati više, pogotovo za studente medicine i biološki usmjerenih studija. Ovo je tekst koji je pripremi magistar farmacije Stribor Marković za grupu Cijepljenje.

Još jednom – šta su virusi

Virusi trebaju žive stanice i ne mogu rasti na ne-živim podlogama. Oni nisu živi organizmi, nego se radi o infektivnim česticama koje sadrže genetički materijal, ali nisu sposobne za samostalno razmnožavanje niti metabolizam.

Virusi su vrlo zahtjevna gospoda i neće živjeti u svakoj stanici koju im date na raspolaganju. Neki virusi napadaju samo manji broj vrsta, zbog toga postoje bolesti koje mogu napadati druge životinje a nas ne mogu. U razvoju cjepiva najteže je bilo naći prikladnog „domaćina“ za uzgoj virusa. Navedimo primjer Louisa Pasteura koji je uzgojio virus bjesnoće na zečevima; virusi bi se umnožili u zečjoj leđnoj moždini.

Da bi virologija i razvoj cjepiva napredovali trebala se razviti stanična biologija. Početkom XX. stoljeća shvatili smo kako stanice izolirane iz živih organizama mogu rasti u hranjivim podlogama, slično uzgoju bakterija.Postoji nekoliko staničnih linija koje koristimo u proizvodnji cjepiva. Upoznajmo ih i proučimo njihovu povijest i biologiju.

Dvije ljudske stanične linije koriste se za proizvodnju cjepiva. To su WI-38 i MRC-5. To su linije čestog tipa stanica u ljudskom tijelu koje zovemo fibroblasti. U opisu se navodi da su diploidne, što, pojednostavljeno, znači da imaju normalan broj kromosoma kao i većina drugih ljudskih stanica. Neke druge stanične linije nemaju takav broj kromosoma. Već smo u grupi čitali potencijalne kontroverze jer se radi o stanicama izoliranim iz ljudskih fetusa (http://bit.ly/38ZK7RX). Pogledajmo objektivne okolnosti u kojima su nastali.

WI-38 ćelijske kulture

WI-38 stanična linija izolirana je iz pluća tromjesečnog ženskog fetusa iz Švedske 1962. godine. Radilo se o prekidu vrlo neželjene trudnoće i povijesna komunikacija koja nam je dostupna pokazuje kako je osoba kasnije bila u potpunosti upoznata s nastankom i korištenjem te stanične linije nastalog iz fetusa. Liniju je izolirao američki znanstvenik Leonard Hayflick u Wistar Institute for Anatomy and Biology u gradu Philadelphiji. Skraćenica WI u imenu linije dolazi od naziva instituta. Leonard je godinu dana prije opisao način dobivanja ljudskih diploidnih stanica. WI-38 stanična linija nije izolirana samo s ciljem uzgoja virusnih sojeva. Na njoj smo puno naučili o „smrtnosti“ ljudskih stanica. Naime, WI-38 stanična linija ne može se dijeliti beskonačno poput tumorskih staničnih linija. Leonard je bio darežljiv i osobno je odnio zamrznute stanice u London, tadašnji Leningrad, Moskvu i – Beograd.

Nekadašnja Jugoslavija je imala privilegiju dobiti na ispitivanje vrijednu liniju koja se pokazala bitnom za razvoj cjepiva u našim krajevima. Tek nakon nekog vremena i brojnih istraživanja WI-38 se pokazala dobrom stanicom za uzgoj virusa. Neki „divlji“ virusi su „utišani“ (atenuirani) na ovoj liniji, poput virusa rubeole. Za dobivanje vrlo efikasnog i sigurnog cjepiva protiv rubeole tajna je bila u uzgoju virusa na WI-38 staničnoj liniji na 30 °C umjesto 37 °C. U neobičnom preokretu sudbine, na toj liniji nastalo je cjepivo protiv virusa koji je izazivao oštećenja fetusa i bio čest razlog prekida trudnoće.

ćelijske kulture WI-38
WI-38 kultura

MRC-5 ćelijska kultura

MRC-5 stanična linija (Medical Research Council cell strain 5) nastala je kasnije, 1970. godine. Izolirana je iz pluća muškog fetusa. U ovom slučaju, prekid trudnoće je bio posljedica vrlo teškog psihičkog stanja 27-godišnje pacijentice o čijim se detaljima zbog privatnosti obitelji ne govori detaljno. MRC-5 linija imala je slične uvjete rasta ali je rasla nešto brže od WI-38 stanične linije što uvijek može biti praktično u istraživanju i proizvodnji.Na MRC-5 i WI-38 liniji, dvjema od brojnih drugih linija izoliranih iz ljudi, mogu se uzgajati niz cijepnih virusa cjepiva protiv rubeole, vodenih kozica, ospica, bjesnoća i virus hepatitisa A.

Kod nas ih nalazite navedene u uputama o cjepivima protiv morbila, parotitisa i rubeole te cjepiva protiv vodenih kozica. U cjepivima poput Priorixa i M-M-RVaxpro komponenta rubeole uzgaja se na tim stanicama. Usprkos ograničenom broju dioba tih stanica, već se desetljećima koriste i koristit će se još duže vrijeme. O strahovima oko strane DNK stranih stanica već smo bili pisali (http://bit.ly/2IrCM3a).

Vero ćelijska linija

Vrlo česta linija koju susrećete u opisima je Vero ćelijska kultura. Vero staničnu liniju izolirali su japanski istraživači Y. Yasumura i Y. Kawakita na sveučilištu Chiba. Zanimljivo, svoj rad su započeli u isto vrijeme kada je i izolirana WI-38 stanična linija a svoje rezultate prvo su objavili na japanskom jeziku 1963. godine. Znanstvenicima nisu motiv bila cjepiva, u svom originalnom radu u samom naslovu govore kako ta linija može poslužiti „u istraživanju tumora“.

Vero linija imenom je inspirirana esperantom koji je tada postajao popularan: Vero znači „istina“, a skraćenica je od „verda reno“, zeleni bubreg, nazvane prema bubregu zelene majmunice (Chlorocebus sabaeus). Vero stanična linija može rasti u daleko većem broju pasaža (dioba) od ljudskih diploidnih stanica WI-38 i MRC-5. Zbog toga je zovemo kontinuirani tip linije. Nakon nekoliko godina otkrilo se kako u njoj jako dobro rastu virusi. 1981. godine francuski znanstvenici prvi su uspješno koristili Vero staničnu liniju za proizvodnju cjepiva protiv dječje paralize i ubrzo su je počeli koristiti i drugi proizvođači.

Što je to čarobno u Vero ćelijskoj liniji?

Nepoznatim spontanim procesom u Japanu došlo je do izmjene genetičkog materijala. Iz 12-tog kromosoma „izletili“ su odnosno nestali ključni geni u kontekstu proizvodnje virusnih cjepiva. Prvi su bili proteini koji koče rast stanice, stoga je i linija postala kontinuirana odnosno mogla je rasti bez ograničenja. Drugi geni su bili geni za tzv. tip I interferone. Tip I interferoni stanici služe za obranu protiv virusa. Lišena tog oruđa, u stanici mogu rasti i vrlo oslabljeni virusi koji se koriste u proizvodnji cjepiva. Vero stanična linija nam služi za proizvodnju cjepiva protiv dječje paralize. Stoga Vero liniju nalazite spomenutu na uputi o cjepivima „5 u 1“ i „6 u 1“, te u inaktiviranim cjepivima protiv dječje paralize. Rotateq i Rotarix cjepiva protiv rotavirusa također se proizvode na ovoj liniji. Premda nije kod nas u upotrebi, zgodno je za navesti kako se novo cjepivo protiv virusa ebole proizvodi na Vero staničnoj liniji.

Embrionalne pileće stanice

Embrionalne pileće stanice (PCEC, purified chick embryo cells) se često koriste za uzgoj virusa. Stanice se dobivaju iz pilećih embrija. Na njima uzgajamo viruse poput ospica i parotitisa u MMR/MPR cjepivima, neke od cjepiva protiv bjesnoće te viruse u cjepivima protiv virusa krpeljnog meningoencefalitisa (KME). Najveći strah kod virusnih cjepiva uzgojenih na ovoj liniji je alergija na jaje.

Cjepiva uzgojena na PCEC mogu imati tragove ovalbumina, proteina bjelanjka jaja. Alergija na jaje nije kontraindikacija za cjepiva poput Priorixa ili M-M-RVaxpro i o pitanjima oko ovalbumina smo već pisali ( i ovdje http://bit.ly/2Ok1p4k i u tekstu ovdje).

Postoji često strah kako te same stanice nalazimo i u cjepivu. Stanice se samo koriste za uzgoj i one same ne završavaju u cjepivu osim u tragovima. Metodama filtracije i centrifugiranja uklanja se potencijalno prisustvo stanica ili njihovih dijelova. Eventualno zaostali proteini ili DNK/RNK stanica ne predstavljaju rizik i o tome smo već pisali. Najbolja je usporedba s mrkvom, mrkvu uzgajamo u zemlji, ali zemlja neće biti dio juhe (osim u tragovima).

Sve stanične linije na kojima se uzgajaju virusi za cjepiva prolaze kontrolu kvalitete o čemu smo već učili u kontekstu sterilnosti cjepiva (http://bit.ly/2ucKWZ1). Kao što ste i vidjeli, relativno vrlo malen broj stanica koristimo za proizvodnju cjepiva jer su ove linije dobro ispitane (karakterizirane).