Ovdje želimo dati komentare na „studije“ koju je objavila talijanska Corvelva. Te se “studije” dosta dijele po internet prostoru te plaše i zbunjuju ljude. Prvo treba nešto reći i o Corvelva. To je udruženje iz Italije koje se protivi vakcinaciji. Za studiju o kojoj ćemo ovdje pričati, primili su oko 50 000 eura kako bi napravili “nezavisnu studiju”…međutim, ovo udruženje ne može napraviti nezavisno istraživanje jer su u startu protiv imunizacije. Italijanski naučnici i ljekari su upozoravali na ovaj problem 2018.
Kako treba i kako ne treba izgledati naučna studija?
Kada je nešto nazvano naučnom studijom ili naučnim radom, ono mora biti objavljeno u relevantnoj literaturu – određenim naučnim časopisima. Moram imate reference i mora se pozivati na određena prethodna istraživanja koja ili potvrđuje ili sa njima polemizira. Postoje naučni radovi sa preko 100 referenci. Da bi rad bio objavljen u jednom takvom časopisu, mora biti peer-reviewed.
To znači da ga pročitaju i procijene stručnjaci iz istog naučnog područja – pregledaju metodologiju, reference, statistiku i rezultate rada. Ovo su vrlo stroge kontrole i što je časopis u kojem je rad objavljen više na listi dobro rangiranih, to su ove kontrole strožije.
Proces je toliko strog da od podnošenja naučnog rada za objavljivanje pa do objavljivanja prođe i više od 6 mjeseci. Također, postoje i predatorski časopisi koji će objaviti praktično bilo što, ako im se plati. Corvelvina studija nije objavljena čak ni ovdje – objavljena je kao PDF file na internetu. U naučnim krugovima, ovakve objave nisu ni vrijedne razmatranja.
Međutim, dovoljno je da se jednom pojavi ovakav papir i da unese paniku mešu stanovništvo, među roditelje. Zato ovdje i obraćamo pažnju na ovu studiju.
Analiziramo za vas
Krenućemo s prvom koju možete naći na sljedećem linku https://bit.ly/2Q2mBtE.
Radi se o Corvelva analizi vakcine Infanrix Hexa, šestovalentna vakcina protiv difterije, tetanusa, velikog kašlja, hepatitisa B, polija (inaktivirano) proizvođača GlaxoSmithKline. U BiH se ova vakcina ne daje.
Ukratko, postoji tvrdnja kako vakcine uopšte ne sadrže ono što je napisano (što je teška optužba) te kako sadrže strane, neobične tvari od kojih neke mogu biti štetne. Krenimo najprije sa zaključkom, a detalje možete pročitati kasnije u tekstu. Teško je napraviti komentar koji nije stručan i dugačak, pa sami procijenite koliko možete razumjeti.
Većina vas koji čitate sada ovaj tekst na ovom blogu nije iz stručnih oblasti -analitičke hemije, farmacije, mediicne i sl. i to se ne očekuje od vas. Ovdje ćemo pokušati sve što govorimo objasniti. Bitno nam je da razumijete i ne želimo nikoga od vas gledati s visoka
1. Autori nisu svoje metode usporedili sa službenim metodama Evropske farmakopeje koje su i nastale jer su najtačnije. Ovo je početnička i/ili namjerna greška razine studentske greške, a ne greške iskusnog analitičara.
2. Napravljen je niz metodoloških grešaka u analizi proteinskog sadržaja, s bombastičnom tvrdnjom kako osnovnog sadržaja cjepiva, a to su antigeni koji stvaraju imunološke reakcije – nema. No, jasno je da nisu uopšte ispitali i riješili efekt matriksa, odnosno drugih tvari u cjepivu koji smetaju u toj analizi. Ovo je doista početnička greška. Autori su vjerojatno mjerili šum. Drugim riječima, nisu znali šta zapravo mjere i od čega su im rezultati.
3. „Nepoznate i opasne“ tvari nisu uopće analitički određene, nego su autori signal na masenoj spektrometriji potražili u informatičkoj bazi a ti sami signali su dvosmisleni. Masena spektrometrija je važna analitička metoda, ali ne može se koristiti be punog poznavanja njenih prednosti i nedostataka. Za puno određivanje moraju napraviti i validirati te tehnike na cjepivu kako bi se anulirao efekt matriksa, uz korištenje analitičkih standarda koji su dostupni.
4. Ovo je pretenciozni „analitički izvještaj“ koji će, na žalost, samo zapaliti one koji o ovom području nemaju pojma ali imaju emocija. To je već puno puta viđen scenarij. Nemojte biti dio tog scenarija. Analitika vakcina i ispitivanja njihovog kvaliteta doista nisu jednostavne stvari. Postoje striktne procedure s razlogom, jer su cjepiva smjesa različitih molekula i metode analize moraju biti prikladne takvoj smjesi, kako ne bi nastali lažni rezultati. Takve tehnike usavršavale su se decenijama.
U naučnim publikacijama koje se bave analitičkom (bio)hemijom postoji jasno pravilo objavljivanja detalja metodologije i uvjeta analize, kako bi druge grupe neovisno mogle reproducirati (ponoviti) rezultate. To je uobičajena praksa koju zahtijevaju u ozbiljnim znanstvenim časopisima.
Proučimo sada elementarne pogreške Corvelva studije, dio po dio.
Results and Discussion 1. Analysis of the composition declared in the vaccine leaflet
U tablici autori su naveli što vakcina deklarirano sadrži, a što su autori našli. Glavni je problem metodologija. Autori se pozivaju na SANIST tehnologiju. SANIST je softverska platforma za analizu analitičkih rezultata putem SACI/ECI-MS metode analize (Surface‐Activated Chemical Ionization/Electrospray Ionization mass spectrometry). Autori se pozivaju na referencu Adriana et al. iz 2015 godine u Rapid Communications in Mass Spectrometry.
No, sami autori originalne studije iz 2015. godine kažu kako je ta metoda dobra za molekule manje molekularne mase (Interest is rapidly rising in the Surface‐Activated Chemical Ionization/Electrospray Ionization (SACI‐ESI) technology due to its application for highly sensitive detection of low molecular weight compounds, in particular when applied for biomarker discovery.) Ovdje autori govore i o proteinima gdje je priprema uzorka sasvim drugačija od molekula manje molekulske mase.
Dakle, morate razumjeti da us proteini (bjelančevine) hemijske supstance velike mase, molekularne mase veće od, primjerice, molekula šećera ili neke masti. Zato ove molekule nazivamo i makromolekule. One se sastoje iz mnogo povezanih podjedinica, koje zovemo aminokiseline. U jednom proteinu može biti 500 i više ovih aminokiselina. Navedena tehnologija iz Corvelva studije nije adekvatna za analizu ovakvih velikih molekula i daće pogrešne rezultate koje je teško interpretirati.
Druga citirana referenca (Cristoni et al., 2017. J. Mass. Spec.) ne udaljava se od predložene metodologije analize malih organskih molekula. U tablici se navodi koje točno molekule su nađene, a koje nisu nađene tom metodom. Nisu našli formaldehid, primjerice, kao ni polimiksin. Jesu li time autogol dali sebi samima, ako on nije u cjepivu Infanrix Hexa, a toliko plaše ljude s njim? Autogol je dvostruki.
Prvo, proizvođačima cjepiva je i želja što bolje ukloniti formaldehid, pa su time talijanski autori samo potvrdili te težnje. Drugi autogol je neznanje. Trebali su paralelno napraviti metodu Europske farmakopeje koje se pridržavaju svi proizvođači cjepiva. Potom su te dvije metode trebali usporediti. Ovo je jedna od početničkih grešaka studentske razine znanosti.
Činjenica je da je njihova metoda nedovoljno osjetljiva za detekciju (pronalazak) formaldehida u vakcini, a nisu analizirali niti jednom drugom metodom, među kojima je već citirana farmakopejska metoda. Ovo vrijedi za sve komponentne u vakcini koje su analizirali, uključujući i rezidualne tragove antibiotika.
Sami „linkovi“ kod pojedinog analita su pogrešni. Ako objavljuju rezultate, očekujemo da daju reference na način analize koji je publiciran.
Ovako su linkovi tek rezultati pretraživanja Googlea s Pubchem ili WHO referencama. Autori navode kako nisu detektirali SACI/ECI-MS SANIST metodom toksoide. Ovdje treba samo ući u metodu. Autori prvo kažu kako su „tražili“ signal (M+nH)n+. Čak i ako ne razumijete, ovo je pogrešno, jer bi to značilo da su autori samo tražili jednu molekulu, cijelog proteina.
Analiza cijelog proteina takozvanim MS tehnikama nije jednostavna, toksoidi nisu jednostavne strukture jer se radi hemijski modificiranim toksini – time ih se čini neopasnima i to se radi pomoću formaldehida. Recimo to se radi sa toksinom tetanusa. Tek kasnije autori sugeriraju kako su radili uobičajenom metodom, nakon cijepanja toksoida enzimom tripsinom. No, tada ovaj signal (M+nH)n+ nije točan u tablici! Ponovo, nisu se potrudili koristiti službenu farmakopejsku metodu, flokulacijski test, koji je i uveden kao najtočniji.
2.1 – 1st analysis: Digestion as it is
Inkubiran je uzorak s enzimom tripsinom i autori kažu „kako nisu našli protein“ nakon inkubacije. Sada da pojasnim: tripsin je enzim kojeg svi mi imamo u našem probavnom traktu i služi nam za razlaganje proteina koje pojedemo. Da nije njega i drugih enzima, mi ne bismo imali ništa koristi od hrane koju pojedemo. Ponavljamo – ovaj enzim razlaže proteine, i autori su protein razložili, pa ga onda tražili!!!!!!!!!!!!!!!! Naravno da ga neće naći.
Na stranu što je ideja određivanja proteina NAKON digestije neobična, autori NE NAVODE METODU detekcije proteina – SACI/ECI-MS kojeg jedinog citiraju to nije. O ovdje se nisu potrudili barem koristiti rutinske farmakopejske metode.
Također, nisu uklonili adjuvant iz vakcine prije obrade tripsinom niti obratili pažnju na specifičnosti cijepanja proteina tripsinom, ako su, eventualno, htjeli dobiti kraće lance i sekvence aminokiseline specifične za neki protein. I ovo je početnička greška. Inače adjuvant je teško odvojiti, ali zašto ići sa metodom koja u startu imam mane pri primjeni u ovom slučaju, a ne probati sa bazičnim metodama? Vrlo čudno metodologija, sve u svemu.

2.2 – 2nd Analysis: Digestion of Precipitate
Ovdje su autori centrifugirali uzorak, mliječna suspenzija koju autori navode potječe od aluminijevog fosfata u Infanrix Hexa, s vezanim proteinima. Autori su nastali talog podvrgnuli enzimu koji cijepa proteine, a potom išli određivati proteine. Isto kao maloprije. I opet, nisu naveli metodu, kao ni u prethodnom slučaju.
2.3 – 3rd analysis: Bradford assay
U ovom dijelu su autori čisti uzorak (očito bez razgradnje proteina) analizirali Bradford metodom, rutinskom tehnikom u kojoj se koristi boja, Coomassie Brilliant Blue G-250, za određivanje proteina. Sada su, logično, našli proteine. Nije jasno da li su tu metodu koristili u prethodna dva dijela eksperimenta? Vrlo su nedorečeni. Usput, Bradford metoda nije ni približno jedina, pogotovo ne u kontekstu Farmakopeje, pa su autori propustili koristiti druge metode i usporediti ih.
2.4 – 4th analysis: Digestion as it is at 57 ° C
Ovdje opisuju metodu digestije proteina tripsinom, a potom su (valjda, jer ne navode) koristili SACI/ECI-MS metodu. U njoj su određivali fragmente proteina. Ovdje postoji velika greška. Autori su koristili čisti uzorak, nisu čak niti naveli korištenje pufera! Ne znamo da li su autori barem to poduzeli kako bi enzim imao optimalne uvjete koje pufer omogućuje.
Naime, različiti enzimi djeluju optimalno u različitim uslovima pH vrijednosti – neki djeluju u kiseloj sredini, neki u baznoj. Da bismo u eksperimentalnim uslovima obezbijedili optimum djelovanja enzima, mi moramo dodati neki pufer (eng. buffer), tvar tj. smjesu jedinjenja koji održavaju pH vrijednost tačno onakvom kakva nam treba.
Ovdje su napravili studentsku pogrešku i nisu PAZILI NA EFEKT MATRIKSA odnosno svih drugih sastojaka u cjepivu. Stranica Skepticalraptor koja je objavila svoju kritiku ove „studije“ navodi mogućnost aluminijevih iona iz cjepiva koji može zaustaviti djelovanje tripsina. Slažem se djelomično s njima s tim ali pojavljuje se drugi problem – ako NE maknemo adsorbens (aluminij fosfat/hidroksid) neće biti samo problem inhibicije (zaustavljanja) enzima, već i adsorpcije odnosno vezanja svih proteina koji samim vezanjem mogu spriječiti djelovanje tripsina.
Autori su prema njihovim vlastitim riječima CENTRIFUGIRALI uzorak nakon digestije, ne vodeći računa o tome da adjuvant može „povući“ sve proteine sa sobom. Tehnički gledano, uklonili su vlastiti – uzorak! Nanosili su supernatant (tvar koja se nakon centrifugiranja smejse izdvoji u gornjem sloju – lebdi) s tragovima proteina. Nisu dokazali efikasnu deapsorpciju proteina („micanje“ proteina s adjuvansa). Nisu dokazali problem takvog matriksa u analizi. To je velika pogreška. Skepticalraptor navodi i mogući utjecaj polisorbata u vakcini i to je moguće, zajedno s ostatkom matriksa.
Autori su „nešto“ našli u tom supernatantu, premda nisu dali nikakve podatke iz originalnog dokumenta ili analitičkog uređaja. Potom su objavili te „sekvence“ pocijepanih proteina, koji navodno sliče na uzorke proteina vrlo egzotičnih gljiva, primjerice prva gljiva je Calocera cornea koja raste na trulom drvetu i njeno prisustvo u cjepivu ravno je znanstvenoj fantastici. Još je fantastičnije potencijalno prisustvo jedne vrste – kruške.
Tablica 2. Ovo je tablica „kontaminanata“. Kontaminante su identificirali SAMO PREKO MOLEKULARNE MASE, pa jedna molekularna masa može biti više mogućih tvari. Na primjer, iz jednog signala našli su da to može biti:2. Salicin 6-phosphate 3. Pachyrrhizone 4. Arnottin II 5. Tetracenomycin F1. Ovako ne možemo tumačiti rezultate jer nekoliko sasvim različitih jedinjenja može imati istu molekulasnu masu.
Drugim riječima, nisu niti naveli koja je količina tih tvari u tragovima, niti su potvrdili njihovu strukturu niti prisustvo. Da bi tvrdili da su doista unutra moraju uzeti analitičke standarde tih tvari i dokazati ih. To nisu napravili.
Time ljude ne-educirane u hemiji i analitici dovode u zabludu. Odjednom ispada da ima 43 „kontaminanta“, a u stvarnosti su detektirali 24 molekule, a da uopšte nisu sigurni koje su to molekule, jer nisu usporedili s analitičkim standardima.
Za tako ozbiljne tvrdnje NIJE dovoljno samo olako uspoređivati s bazama podataka i ne napraviti ništa drugo. Osim toga, nisu naveli kvantitet, odnosno koliko ih ima. Da je doista, recimo prisutan Atovaquone, antimalarik (a vjerojatno nije, sve dok autori doista to ne dokažu), i ako ga ima pikogram – koja je biološka relevantnost toga?
Tablica 3
Tablica 3 je ista pogreška kao i tablica 2, samo su autori izdvojili toksične molekule. Greška metodologije i interpretacije je ista kao i u tablici 2.
U ovoj su studiji odmah skočili na zaključak da u istraživanoj vakcini nema antigena kojih treba biti, a zapravo se dogodilo to da su koristeći pogrešnu metodologiju “otkačili” komadiće molekula – kraće lance sa stvarnih antigena i oni se nisu mogli registrirati kao takvi. To ne znači da antigena nema, nego znači da su ga voditelji studije u procesu uništili, rasformirali i promijenili.
Napisali: Stribor Marković, dr. sc. farmaceutskih znanosti i Jelena Kalinić, diplomirani biolog
Ovaj tekst je prilagođen sa FB stranice Cijepljenje / Vakcinacija – grupa za sve koji imaju pitanja i nedoumice.
O nama: Društvo “Nauka i svijet” je osnovano 2017. godine, a bavi se promocijom prirodnih nauka, borbom protiv dezinformacija u sferi nauke, protiv pseudonauke i za bolje obrazovanje u STEM oblasti. Predsjednik je prof, dr. Nenad Tanović.